Rządowy projekt ustawy o nasiennictwie

niespecyficzne; ten typ reakcji eliminuje się przez stosowanie gammaglobuliny
o wysokim stopniu specyficzności;
5) inny rodzaj reakcji niespecyficznych jest związany z obecnością lektyn

w ekstraktach, które przylegają do powierzchni polistyrenu i może powstać
specyficzne wiązanie lektyna – glikoproteina z enzymem i przeciwciałem;
6) w celu eliminacji ryzyka powstania reakcji niespecyficznych, o których mowa
w pkt 5:
a) zwiększa się objętość roztworu powlekającego w porównaniu z objętością
roztworu antygenu i koniugatu, co ogranicza kontakt lektyny z polistyrenem,
b)
do ekstraktu lub koniugatu wprowadza się nadmiar glikoproteiny,

w szczególności albuminy;
7) niespecyficzną adsorpcję koniugatu można wyeliminować, stosując detergenty
(Tween 20) oraz blokując niezajęte centra aktywne fazy stałej przez albuminę
surowicy wołowej (BSA);
8) dodatkowej adsorpcji koniugatu na powierzchni fazy stałej, będącej wynikiem
częściowego odparowania roztworów w czasie inkubacji, zapobiega się przez
przykrycie gumową pokrywką lub folią; nie stawia się płytek jedna na drugiej;
9) pobranie niewłaściwego materiału do oceny (zbyt młode rośliny) zmniejsza
wykrywalność wirusa.
15. Interpretacja wyników pomiarów absorpcjometrycznych wymaga uwzględnienia
zależności ekstynkcji (absorbancji) od stężenia, która ma postać funkcji

y = a1 + a2 x2 przedstawionej na schemacie:


A



3,0

c3



2,0

c2



1,0
c1
gdzie:
c
A – oznacza ekstynkcję (absorbancję),
c – oznacza stężenie.
16. Ekstynkcja (absorbancja) jest liniową funkcją stężenia w takim zakresie stężeń,
w którym prawdopodobieństwo absorpcji światła przez wszystkie cząsteczki jest
identyczne; w wyższych stężeniach występują odchylenia od funkcji liniowej, co
oznacza zmianę czułości i precyzji pomiaru; dla testu ELISA (v = 0,2 cm3, długość
fali λ = 405 nm) zależność liniowa występuje w zakresie 0-2,00 absorbancji.

44
17. W zakresie 2,00-3,00 ekstynkcji (absorbancji) precyzja odczytu zmniejsza się o
połowę, a dla wartości powyżej 3,00 odczyty mają znaczenie tylko jakościowe.
18. Odczynniki i roztwory:
1) odczynniki:
a) koniugat specyficznej gammaglobuliny z alkaliczną fosfatazą,
b) fosforan 4-nitrofenylu,
c) dwuetanoloamina,
d) płytki polistyrenowe,
e) woda podwójnie destylowana lub dejonizowana;
2) roztwory buforowe:
w 10 dm3 wody rozpuścić
2 g KH
zbuforowany roztwór soli PBS
2PO4,
1
29 g Na
o pH 7,4
2HPO4 · 12 H2O,
80 g NaCI,
2 g KCl
bufor do powlekania polistyrenu
w 1 dm3 wody rozpuścić
2
gammaglobuliną
1,59 g Na2CO3,
o pH 9,6
2,93 g NaHCO3
roztwór immunoglobuliny w buforze 2
3
sporządzić zgodnie ze wskazaniami producenta
o pH 9,6
w 1 dm3 PBS rozpuścić
bufor ekstrakcyjny
4
20,0 g PVP (poliwinylopirolidonu M–25 000),
o pH 7,4
0,5 cm3 Tween 20
w 1 dm3 PBS rozpuścić
2,0 g BSA,
5
bufor do inkubacji koniugatu
20,0 g PVP,
0,2 g MgCl2,
0,5 cm3 Tween 20
6
roztwór koniugatu
sporządzić zgodnie ze wskazaniami producenta
w 800 cm3 wody rozpuścić
bufor substratowy
7
97 cm3 dwuetanoloaminy, doprowadzić do
o pH 9,8
pH 9,8 i uzupełnić wodą do 1,0 dm3
rozpuścić 20,0 mg sześciowodnej soli
8 roztwór
substratu
dwusodowej fosforanu 4-nitrofenylu w 20,0 cm3
buforu substratowego 7
roztwór do przemywania
9
w 5,0 dm3 PBS rozpuścić 2,5 cm3 Tween 20
o pH 7.4
roztwór do przerywania reakcji
rozpuścić 12,0 g NaOH w wodzie,
10
enzymatyczncj - 3M roztwór NaOH
ochłodzić i uzupełnić do 100 cm3

19. Sposób przygotowywania i przechowywania odczynników i roztworów:
1) koniugat specyficznej gammaglobuliny z alkaliczną fosfatazą gammaglobuliny
(surowice) – przechowuje się zgodnie ze wskazaniami producenta;
2) fosforan 4-nitrofenylu (chemicznie czysty) – przechowuje się w eksykatorze z
żelem krzemionkowym, w temperaturze minus 20ºC;

45
3) dwuetanoloamina (chemicznie czysta) – przechowuje się w ciemności;
4) bufory i roztwory – przechowuje się w temperaturze 4ºC, a ilość przeznaczoną
do bezpośredniego użycia – w temperaturze pokojowej;
5) roztwór substratu 8 – przyrządza się w butelce z ciemnego szkła, bezpośrednio
przed użyciem;
6) roztwory surowic i koniugatu – wykorzystuje się do analizy, przed upływem
kilku godzin od przygotowania;
7) silikonowanie szkła w celu wyeliminowania adsorpcji surowicy i koniugatu na
powierzchni naczyń – wykonuje się kolejno następujące czynności:
a) myje w mieszaninie chromowej, dokładnie wypłukuje wodą destylowaną
i suszy w temperaturze 100ºC,
b) przepłukuje 2% silanem rozpuszczonym w CCl4 (czterochlorek węgla),
c) suszy strumieniem powietrza,
d) przepłukuje alkoholem etylowym (alkohol może być skażony metanolem),
e) suszy strumieniem powietrza,
f) przepłukuje wodą destylowaną i suszy strumieniem powietrza;
8) bufor ekstrakcyjny – przygotowuje się na kilka godzin przed użyciem;
9) płytki pokryte surowicą (gammaglobuliną) – można zamrozić i przechowywać
w temperaturze minus 20ºC, przez 6 miesięcy;
10) woda podwójnie destylowana lub dejonizowana – przydatność wody do
sporządzania roztworów można sprawdzić konduktometrycznie; przewodność
właściwa nie powinna przekraczać 10 µScm-1;
11) płytki polistyrenowe – mogą być przechowywane do czasu wystąpienia
zmętnienia lub innych zmian właściwości optycznych.
20. W celu zabezpieczenia przed rozwojem mikroorganizmów, do buforów można
dodać azydek sodu (NaN3) o stężeniu końcowym wynoszącym 0,02%.
21. Do sporządzania roztworów używa się odczynników oznaczonych cz.d.a. (czyste do
analizy).
22. W celu uzyskania właściwego pH roztworów, miareczkuje się 1M roztworem HCI
lub 0,1M roztworem NaOH.
23. Sposób wykorzystania płytek polistyrenowych do testu ELISA:
1) test ELISA jest wykonywany na płytce z tworzywa sztucznego, o właściwościach
adsorpcji białka;
2) płytka, o której mowa w pkt 1:
a) powinna mieć 96 płaskodennych zagłębień każde o pojemności 0,35 cm3,
rozmieszczonych w 8 rzędach oznaczonych literami i 12 kolumnach
oznaczonych cyframi, zgodnie ze schematem,

46

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


A



B



C


D



E



F



G


H



b) może mieć liczbę zagłębień, ich rozmieszczenie, pojemność oraz
oznaczenie, inne niż określone w lit. a, zgodne ze wskazaniami producenta
płytek;
3) podczas wykonywania testu mogą wystąpić reakcje niespecyficzne (reakcje
barwne), których najczęstszymi przyczynami są:
a) niedokładne wypłukanie płytki lub
b) różnice w temperaturze między środkowymi a skrajnymi zagłębieniami płytki;
4) w celu wyeliminowania ewentualnych błędów w trakcie wykonywania testu, na
każdej płytce umieszcza się próbki kontrolne:
a) jedną próbkę kontroli negatywnej, przygotowaną ze zdrowej rośliny ziemniaka
w zagłębieniu B1 oraz
b) jedną próbkę kontroli pozytywnej, przygotowaną z rośliny ziemniaka
zainfekowanej wirusami w zagłębieniu C1;
5) do kalibracji płytki w ocenie spektrofotometrycznej używa się próbki odniesienia,
którą umieszcza się w zagłębieniu A1; próbkę tę stanowi bufor;
6) w pozostałych zagłębieniach na płytce umieszcza się sok z poszczególnych
roślin badanej próbki; przyjmuje się, że do pierwszych zagłębień na płytce
nanosi się sok z roślin, u których wzrokowo stwierdzono porażenie wirusowe, a
w pozostałe zagłębienia sok z pozostałych roślin, według kolejności ich
wysadzenia
w szklarni.
24. Uproszczona metoda laboratoryjnej oceny zdrowotności polega na dokładnym
przeanalizowaniu wyników oceny polowej plantacji oraz dokumentacji stosowanych
zabiegów i obserwacji plantacji, określonych w wymaganiach szczegółowych.
47
Załącznik nr 7

SZCZEGÓŁOWY OPIS METODY OCENY CECH ZEWN TRZNYCH SADZENIAKÓW
ZIEMNIAKA ORAZ WYSADKÓW RO LIN DWULETNICH
I. Ocena cech zewnętrznych sadzeniaków ziemniaka
Ocenie cech zewnętrznych poddane mogą być sadzeniaki, które:
1) są czyste, suche, bez objawów zaparzenia lub nadmarznięcia;
2) są posortowane zgodnie z wymaganiami szczegółowymi;
3) posiadają temperaturę wyrównaną z temperaturą otoczenia.
Ocenie cech zewnętrznych poddaje się partie sadzeniaków ziemniaka:
1) znajdujące się w zamkniętych i zaopatrzonych w etykiety opakowaniach;
2) znajdujące się w opakowaniach otwartych;
3) nieopakowane (partie luzem).
Po dokonaniu oceny cech zewnętrznych partii sadzeniaków ziemniaka, o których mowa
w ust. 2 pkt 2 i 3, partie pakuje się, plombuje oraz zaopatruje w etykiety, w
obecności kwalifikatora. Nie dotyczy to tej części ocenionej partii, którą jej właściciel
pozostawia do wysadzenia na własnym polu.
Partii sadzeniaków ziemniaka poddawanej ocenie cech zewnętrznych nadaje się numer
zgodnie z przepisami w sprawie oznaczania partii materiału siewnego.
Do oceny cech zewnętrznych pobiera się losowo próbę, którą stanowi określona liczba
opakowań lub odpowiednia masa sadzeniaków, zależna od wielkości ocenianej
partii oraz wielkości opakowań jednostkowych (w tym partii luzem), zgodnie z
poniższą tabelą:
Wielkość partii w tonach
powy
Wielko
żej 5,0 powyżej 10,0 powyżej 20,0 powyżej 35,0
ść
do 5,0
do 10,0
do 20,0
do 35,0
do 50,0
opakowań
liczba opakowań lub masa sadzeniaków stanowiących
próbę do oceny cech zewnętrznych
do badań ogólnych:
worki 50,0 kg
3 4 5 6 8
worki 25,0 kg
5 7 8
12
opakowania typu
big–bag lub
1 2
3
skrzyniopaleta
partia luzem
100 kg 400
kg
do badań szczegółowych:
worki 50,0 kg
1 3
4
worki 25,0 kg
4 8
opakowania typu
big–bag lub
50 kg
2 x 50 kg
3 x 50 kg
skrzyniopaleta
partia luzem
50 kg
2 x 50 kg
3 x 50 kg

Przed przystąpieniem do badań szczegółowych dokonuje się pomiaru temperatury
otoczenia.

48