Rządowy projekt ustawy o nasiennictwie

a) powyżej 5 – druga połowa stycznia,
b) równej 5 – pierwsza połowa lutego,
c) poniżej 5 – od dnia 15 lutego;
3) gdy dokonanie oceny wirusa za pomocą oceny wzrokowej jest trudne i w
przypadku pozornych objawów liściozwoju wykonuje się test ELISA.
21. Ocena porażenia wirusem Y (PVY):
1) objawy porażenia rośliny wirusem Y są cechą odmianową;
2) wyższa temperatura oraz lepsze naświetlenie sprzyja pojawianiu się na liściach
nekroz wywołanych wirusem Y; w innych warunkach na tych samych odmianach
objawy są słabsze, w szczególności w postaci ostrej mozaiki i deformacji liści;
3) odmiany o słabej reakcji objawowej na zakażenie wirusem Y wymagają
wykonania testu ELISA.
22. Ocena porażenia wirusem M (PVM):
1) wirus M może wywoływać bardziej lub mniej wyraźne objawy, zależnie od
odmiany;
2) objawy wywołane przez wirus M najbardziej ujawniają się przy prowadzeniu
roślin w obniżonej temperaturze;
3) wysokie temperatury w połączeniu z dużą intensywnością światła mogą
powodować maskowanie objawów wirusa M, nawet u odmian zwykle silnie
reagujących.
23. Ocena porażenia wirusem X (PVX):
1) objawy wywołane przez wirus X najbardziej ujawniają się przy prowadzeniu roślin
w obniżonej temperaturze i słabszym oświetleniu, podobnie jak w przypadku
wirusa M;
2) typowym objawem porażenia wirusem X jest mozaika międzynerwowa;
3) jednoczesne występowanie wirusów X i M może wywołać ostrą mozaikę, której
objawy są podobne do objawów powodowanych przez wirus Y.
24. Ocena porażenia wirusem S (PVS):
1) występowanie wirusa S w próbie oczkowej jest w zasadzie bezobjawowe;
2) wykonuje się test ELISA.
25. Ocena porażenia innymi wirusami w szczególności:
1) objawem porażenia wirusem nekrotycznej kędzierzawki tytoniu (rattle) jest żółta
plamistość liści w połączeniu z przewężeniem listków oraz nekrozami łodyg;
2) pozostałe wirusy stwierdza się wykonując test ELISA.
26. W przypadku nekroz pochodzenia:
1) fizjologicznego, na przekroju anatomicznym nerwów liści są widoczne
uszkodzenia miękiszu wewnętrznego bez uszkodzenia epidermy;
2) wirusowego, na przekroju anatomicznym nerwów liści jest widoczne uszkodzenie
epidermy.
II. Test
ELISA

1.
Test ELISA przeprowadza się w pomieszczeniach o temperaturze 20–21ºC

i wykorzystuje do diagnostyki wirusów mających istotny wpływ na plony ziemniaka,
w szczególności:
1) wirusa liściozwoju ziemniaka (PLRV);
2) wirusa Y ziemniaka (PVY);
3) wirusa M ziemniaka (PVM);
4) wirusa S ziemniaka (PVS);

39
5) wirusa X ziemniaka (PVX).
2. Wykrywania chorób wirusowych testem ELISA dokonuje się na liściach roślin
wyrosłych w warunkach kontrolowanych w próbie oczkowej.
3. Test ELISA jest wykonywany przy wykorzystaniu selektywnej adsorpcji cząstek
wirusa przez gammaglobulinę osadzoną na polistyrenie oraz ocenę ilości tych
cząstek metodą fotometryczną za pośrednictwem reakcji katalizowanej przez enzym
sprzężony
z przeciwciałem.
4. Etapy wykonania testu ELISA:
1) gammaglobulina (przeciwciało) jest adsorbowana na powierzchni polistyrenu, a
jej nadmiar jest wymywany;
2) cząstki wirusa są wychwytywane z surowego ekstraktu materiału roślinnego
przez przeciwciało osadzone na polistyrenie; nieprzereagowany materiał jest
wymywany;
3) do zagłębień wprowadza się koniugat przeciwciała z enzymem (alkaliczną
fosfatazą); przeciwciała koniugatu łączą się z cząstkami wirusa zatrzymanymi w
zagłębieniach płytki; zachodzi zjawisko zwane podwójnym sandwiczem (double
antibody sandwich);
4) po wymyciu nieprzereagowanego materiału, wprowadza się roztwór fosforanu
4-nitrofenylu; zachodzi reakcja hydrolizy katalizowana przez alkaliczną fosfatazę
w wyniku której powstaje 4-nitrofenol; w środowisku zasadowym związek ten
występuje w postaci jonu fenolanowego, którego maksimum absorpcji odpowiada
długości fali λ = 405nm;
5) maksimum absorpcji przy określonej długości fali umożliwia oznaczenie ilościowe
4-nitrofenolu z zastosowaniem metody spektrofotometrycznej lub wzrokowej, na
podstawie oceny intensywności zabarwienia.
5. Sposób pobierania materiału roślinnego do oceny:
1) z rośliny uzyskanej w próbie oczkowej (w 5–6 tygodniu wzrostu) pobiera się
trzeci (licząc od wierzchołka) dobrze rozwinięty liść;
2) do uzyskania soku z liści stosuje się specjalne praski;
3) sok rozcieńcza się buforem ekstrakcyjnym w stosunku objętościowym 1:20, w
celu zmniejszenia ryzyka wystąpienia reakcji niespecyficznych;
4) rozcieńczony sok nanosi się na płytkę niezwłocznie po jego otrzymaniu;
5) przed pobraniem soku, do probówek wprowadza się po 0,8 cm3 buforu
ekstrakcyjnego;
6) do każdej probówki dodaje się po 1 kropli soku; ilość ta wystarcza do wykonania
testu ELISA na obecność wirusów PVY, PLRV, PVM.
6. Po każdej próbie spłukuje się dokładnie wałki praski przez 6–10 sekund, w
zależności od zastosowanego ciśnienia wody; zbyt krótkie spłukiwanie powoduje
ryzyko przenoszenia wirusa na następne badane próby.
7. Pobrany sok może być przechowywany w temperaturze ok. 4ºC przez 24 godziny,
co może wpłynąć na obniżenie czułości pomiaru; zamrażanie jest niedopuszczalne.
8. Adsorpcja immunoglobulin na polistyrenie:
1) do zagłębień w płytce wprowadza się roztwór immunoglobulin przeciw
określonemu wirusowi, w ilości 0,22 cm3 lub zgodnie ze wskazaniami producenta
stosowanych immunoglobulin, za pomocą dozownika wielokanałowego;
2) płytki zabezpiecza się przed parowaniem, przykrywając je gumowymi
przykrywkami lub folią;

40
3) inkubację przeprowadza się przez 4 godziny, w temperaturze 37ºC; w tym czasie
cząstki immunoglobulin adsorbują się na ściankach zagłębień, powlekając ich
powierzchnię;
4) po zakończeniu procesu powlekania płytek, nadmiar immunoglobulin usuwa się
energicznie wytrząsając roztwór z zagłębień;
5) wszystkie cząstki immunoglobulin, które nie zostały zaadsorbowane na
ściankach płytki, dokładnie wypłukuje się roztworem do przemywania;
6) do zagłębień płytki wprowadza się po 0,3 cm3 roztworu do przemywania
i pozostawia na 3 minuty; czynność tę powtarza się 3 lub 4 razy.
9. Immunosorpcja wirusa:
1) do zagłębień płytki wprowadza się rozcieńczony buforem sok z roślin w ilości
0,2cm3; płytki zabezpiecza się przed parowaniem;
2) w czasie inkubacji, cząstki wirusa zawarte w soku adsorbują się na osadzonej
wcześniej immunoglobulinie, tworząc drugą warstwę na powierzchni zagłębień
płytki;
3) po zakończeniu inkubacji nadmiar cząstek wirusa usuwa się wytrząsając resztki
rozcieńczonego soku; płytkę dokładnie wypłukuje się roztworem do
przemywania.
10. Immunosorpcja koniugatu:
1) w drugim dniu wykonywania testu, do zagłębień w płytce wprowadza się po 0,2
cm3 roztworu koniugatu (immunoglobulina sprzęgnięta z alkaliczną fosfatazą);
2) płytkę zabezpiecza się przed parowaniem;
3) w czasie inkubacji cząsteczki koniugatu przyłączają się do wirusa wcześniej
osadzonego na ściankach, tworząc trzecią warstwę na powierzchni zagłębień;
4) inkubację wykonuje się przez 4 godziny w temperaturze 37ºC;
5) po zakończeniu inkubacji, nadmiar koniugatu usuwa się wytrząsając i wypłukując
płytkę.
11. Reakcja hydrolizy katalizowana przez enzym alkaliczna fosfataza:
1) do zagłębień w płytce wprowadza się roztwór substratu (fosforan 4-nitrofenylu)
w ilości 0,2 cm3; płytkę zabezpiecza się przed parowaniem;
2) osadzone wcześniej na ściankach płytki cząsteczki enzymu połączone
z immunoglobulinami katalizują reakcję hydrolizy, w wyniku której powstaje
4-nitrofenol; w środowisku zasadowym związek ten występuje w postaci jonu
fenolanowego o barwie żółtej;
3) intensywność zabarwienia zależy od koncentracji wirusa w badanej próbce soku
– im wyższa koncentracja wirusa, tym intensywniejsze zabarwienie roztworu;
4) proces inkubacji przeprowadza się w ciemności, w temperaturze pokojowej
wynoszącej 20ºC, przez 60 minut;
5) reakcję przerywa się za pomocą 3M roztworu NaOH, dodając po 1 kropli
roztworu do zagłębienia.
12. Ocena wyników testu ELISA:
1) ocena wzrokowa:
a) może być stosowana tylko w przypadku wysokiej koncentracji wirusa, dającej
widoczne zabarwienie roztworu,
b) brak zabarwienia roztworu w zagłębieniu uznaje się za reakcję negatywną,
natomiast wystąpienie zabarwienia – za reakcję pozytywną;
2) zakresy wartości ekstynkcji (absorbancji) umożliwiające dokonanie oceny
wizualnej, gdy wartość E405 wynosi:

41
a) poniżej 0,3 – reakcja jest niewidoczna dla oka,
b) 0,3–0,6 – ocena wzrokowa jest wątpliwa,
c) powyżej 0,6 – występuje wyraźna reakcja barwna;
3) ocena
spektrofotometryczna:
a) pomiaru spektrofotometrycznego dokonuje się według wzoru wynikającego
z prawa Lamberta-Beera:
A
= a × c ×1
405
405

gdzie:
A
– oznacza wartość ekstynkcji (absorbancji),
405
c – oznacza stężenie roztworu odpowiadające stężeniu wirusa w próbie,
1 – oznacza długość drogi optycznej światła, odpowiadającą wysokości słupa
roztworu w zagłębieniu,
a – oznacza współczynnik absorpcji, zależny od długości fali światła,
b) mierzoną wartością jest przyrost absorbancji (A) w jednostce czasu,
c) na podstawie wartości, o której mowa w lit. b, można określić koncentrację
wirusa w roślinie (analiza ilościowa).
13. Sposoby określenia wartości progowej:
1) wartością progową jest granica między roślinami zdrowymi i porażonymi;
2) roślinę uznaje się za zakażoną wirusem (reakcja pozytywna), jeżeli odczyt
ekstynkcji (absorbancji) zmierzonej po 60 minutach reakcji przy długości fali 405
nm w sposób istotny różni się od ekstynkcji (absorbancji) odpowiadającej roślinie
zdrowej (reakcja negatywna);
3) wynik każdego pomiaru zawiera błąd, którego miarą jest odchylenie
standardowe; wartość odchylenia standardowego oblicza się według wzoru:

1
∑x − (n∑x)2
2
s =

n −1

gdzie:
s – oznacza odchylenie standardowe,
x – oznacza wartość absorpcji pojedynczego pomiaru dla rośliny zdrowej,
n – oznacza liczbę pomiarów dla roślin zdrowych;

42
4) wartość progową oblicza się według wzoru:

wp = x + 3s
gdzie:
wp – oznacza wartość progową,
x – oznacza średnią arytmetyczną wartości absorpcji dla roślin zdrowych,
s – oznacza odchylenie standardowe;
5) wykorzystanie odchylenia standardowego w diagnostyce przedstawia schemat
rozkładu normalnego:


Przedział ufności
Przedział
Przedział
krytyczny
krytyczny



68,0%
95,5%


- 3s
- 2s
- s
s
2s
3s
x

Patologia
Wątpliwe Ostrzeg.
Diagnostycznie pewne
Ostrzeg.
Wątpliwe
Patologia


Norma

gdzie:
x – oznacza średnią arytmetyczną wyników pomiarów (co najmniej 5 powtórzeń) dla
rośliny zdrowej,
s – oznacza odchylenie standardowe,
x + 3s – oznacza wartość progową;
6) rośliny uznaje się za zakażone, jeżeli otrzymany wynik jest wyższy od wartości
progowej;
7) przy dużej liczbie pomiarów, jako wartość progową można przyjąć bezwzględną
wartość ekstynkcji 0,1 lub 0,2.
14. Przyczyny błędów w teście ELISA i ich eliminowanie:
1) cząstki wirusów w surowych ekstraktach materiału roślinnego są rozmieszczone
nierównomiernie w fazie ciekłej;
2) możliwa jest agregacja cząstek wirusa i adsorpcja na fragmentach struktury
komórkowej;
3) przez stosowanie niskich obrotów odwirowania może nastąpić ujednolicenie
układu, co powoduje utratę aktywności antygenu;
4) obecność przeciwciał wirusa w reagującym układzie może spowodować reakcje

43